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胸膜肺炎放线杆菌田间分离株的血清分型

  一种新的基于聚合酶链反应的测试,有助于对目前所有已知的胸膜肺炎放线杆菌血清型进行分型,并可用于筛选最合适的疫苗。

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  确定胸膜肺炎放线杆菌的血清型对其控制非常重要,因不同的血清型具有不同的毒力水平(取决于地理区域),并且该信息可用于筛选最合适的疫苗(Gottschalk,2015年)。基于荚膜,有18种已知的胸膜肺炎放线杆菌血清型(Boss_等人,2018a),其中1、5、9和11型是强毒力菌株。根据其对NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的需求将其分为生物型1和生物型2(不依赖NAD的分离株)。 内容来自dedecms

  传统上,血清学实验包括凝集、共凝集、免疫扩散、间接血凝和环沉淀,其常被用于确定血清型。但其需要高滴度的特异性抗血清,且存在血清型(如3/6/8和1/9/11)之间的交叉反应。我们发现,大多数英国和爱尔兰的血清型3分离株实际上是血清型8(ONeill等人,2010年)。由于存在这类问题,我们研发了基于分子的测试方法,利用聚合酶链反应(PCR)来扩增荚膜生物合成基因中的血清型特异性DNA序列(Boss_等人,2014)。基于这些血清型特异性序列,可以进行16种血清型特异性试验(Boss_等人,2017年),并在最近发现了血清型17和18(Boss_等人,2018a)。随着血清型16-18的发现,我们决定开发一种基于聚合酶链反应(PCR)的检测方法,可以对所有已知的胸膜肺炎放线杆菌进行血清分型。然而,不能通过PCR区分血清型9和11,因为它们的荚膜位点几乎相同(Boss_等人,2018b),且不能通过血清学测试对其进行分离(Gottschalk,2015)。基于聚合酶链反应的检测必须确认分离物为胸膜肺炎放线杆菌并确定特定血清型。为了确认胸膜肺炎放线杆菌,我们使用引物扩增胸膜肺炎放线杆菌特异性apxIV基因的418 bp区域(Schaller等人,1999)。

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  然而,由于血清型种类众多(n=18),我们制定了2种多重PCR(MPCR)检测方法,每种检测方法均能检测多种血清型。MPCR1检测血清型1-12和15(图1a), MPCR2检测血清型13-14和16-18(图1b)。在MPCR1中仅扩增apxIV条带的分离株需在MPCR2中进一步测试。

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  图1.胸膜肺炎放线杆菌参考菌株血清型特异性检测实验,(A)mPCR1用于检测血清型1-12和15,(B)mPCR2用于检测血清型13-14和16-18。血清型参考菌株1-18 =泳道1-18。2种mPCR均显示418bp的apxIV扩增子,证实样本是胸膜肺炎放线杆菌(改编自Bossé等,2018b)。

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  可通过设计的引物来扩增NADV基因1339bp片段, MPCR2确定了生物类型。仅在生物型2参考菌株(血清型13-14)中检测到1339 bp的NADV扩增子。应该注意的是,其它血清型(如2、4、7和17)被认为是生物型2,一些北美血清型13分离株被认为是生物型1(Gottschalk,2015年)。 内容来自dedecms

  用于PCR的纯化DNA模板(来自培养细菌或组织样本),可通过使用商品试剂盒,煮沸的细菌全细胞裂解物或平板培养物的菌落获得。使用纯化的DNA可获得最佳的结果,如果菌落非常粘稠且难以裂解,则使用菌落PCR可能会产生部分/假阴性结果,如3种临床血清型2分离株所示,菌落PCR仅扩增了血清型特异性条带,但使用纯化的DNA还扩增了apxiv特异性带(图2)。极少数情况下,即使使用纯化的DNA,也无法扩增apxIV(Bossé等,2014)。当发生这种情况时,可以使用替代的apxIV引物(oAPXIV-TSP1 / 2)(Tegetmeyer等,2008)来确认胸膜肺炎放线杆菌。可通过使用mPCR1和mPCR2来鉴定新的血清型,正如我们鉴定了血清型17和18(Bossé等,2018a)。产生apxIV条带但不含血清型特异性扩增子的胸膜肺炎放线杆菌分离株可能是一种新的血清型,缺乏血清型特异性带可能是由于引物不匹配,或由于存在干扰荚膜位点的插入元件。对该分离株的全基因组测序将证实这一疑问。 dedecms.com

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  图2.用MPCR1对3个临床血清型2分离株的纯化菌落聚合酶链反应(泳道1-3)和DNA(泳道4-6)的条带扩增进行比较。 织梦内容管理系统

  总之,监测畜群或国家的胸膜肺炎放线杆菌血清型对疾病控制很重要。我们的血清分型PCR(mPCR1和mPCR2)是鉴定毒力血清型,正确使用疫苗(商品或自体疫苗)以及预防将胸膜肺炎放线杆菌分离株感染猪被引入阴性猪群的有用工具。此外,我们的方法有鉴别新的胸膜肺炎放线杆菌血清型的潜力,并可促进诊断方法的改善。

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